|
|
|
|
|
Adaptado de Shimanuki, Hachiro, and David A. Knox. 1990. Diagnosis of Honey Bee Diseases. U.S. Department of Agriculture, Agriculture Handbook AH-690:
La tiamina (vitamina B1) y algunos aminoácidos se requieren para el crecimiento de Paenibacillus larvae larvae. Los medios de cultivo rutinarios tales como caldo nutriente no soportan el crecimiento de este organismo. El buen crecimiento vegetativo ocurre en la infusión del corazón del cerebro de Difco fortificada con 0,1 mg clorhidratos de la tiamina del magnesio por el litro de medio (BHIT) y ajustada al pH 6,6 con HCl, pero la esporulación no ocurre.
El crecimiento y la esporulación satisfactorios ocurren en el extracto de levadura, el almidón soluble, y los media de la glucosa recomendados por Bailey y Lee (1962). El media puede ser líquido, semisolido (0,3% agares), o sólido (agar del 2%). Para más información sobre la esporulación, vea Dingman y Stahly (1983).
Las esporas de Paenibacillus larvae larvae también se reproducen en la hemolinfa de las larvas, de las crisálidas, y de los adultos de la abeja melífera cuando son introducidas por la inyección en forma artificial (Michael 1960, Wilson y Rothenbuhler 1968, Wilson 1970).
Para cultivar Paenibacillus larvae larvae, las suspensiones de la espora son preparadas mezclando el material enfermo (escamas) con agua estéril de 9 mL en tubos del tapón de tuerca. (los aplicadores de la esponja de algodón se utilizan para quitar y para transferir las escalas o costras del panal a los tubos.) La suspensión es calor dada una sacudida eléctrica en 80 grados C por 10 minutos (tiempo eficaz) para matar a bacterias que no forman esporas. Una esponja de algodón estéril se utiliza para separar uniformemente una porción de la suspensión (aproximadamente 0,2 mL) sobre la superficie de las placas de agar de BHIT, que entonces se incuban por 72 horas en 34 grados C. Colonias individuales son pequeñas (1-2 milímetros) y opacas; sin embargo, si se inoculan una gran cantidad de esporas de Paenibacillus larvae larvae, una capa sólida de crecimiento cubrirá la placa.
No hay métodos de confianza para hacer cuentas de placa de Paenibacillus larvae larvae porque menos de 10 por ciento de las esporas producirán el crecimiento visible en el media actualmente disponible (Shimanuki 1963). Calibrando nuestros métodos usando cuentas de la espora y de placa, nos hemos determinado que un mínimo de 100 esporas de Paenibacillus larvae larvae está requerido para producir el crecimiento visible en BHIT.
Referencias:
Bailey, L., and D.C. Lee. 1962. Bacillus larvae: Its cultivation in vitro and its growth in vivo. Journal of General Microbiology 29:711-717.
Dingman, D.W., and D.P. Stahly. 1983. Medium promoting sporulation of Bacillus larvae and metabolism of medium components. Applied and Environmental Microbiology 46:860-869.
Michael, A.S. 1960. A new technique for studying bee diseases. XVII International Beekeeping Congress, Bologna-Roma, 1958, Official Report, Second Volume, pp. 73-77. Imola Tipografia Galeati, 1960.
Shimanuki, H. 1963. In vitro and in vivo studies of Bacillus larvae. Ph.D. dissertation, Iowa State University of Science and Technology, 150 pp., Ames, Iowa.
Wilson, W.T., and W.C. Rothenbuhler. 1968. Resistance to American foulbrood in honey bees. VIII. Effects of injecting Bacillus larvae spores into adults. Journal of Invertebrate Pathology 12:418-424.
Wilson, W.T. 1970. Inoculation of the pupal honeybee with spores of Bacillus larvae. Journal of Apicultural Research 9:33-37.